lunes, 16 de junio de 2014

Técnicas moleculares de investigación en Paleontología Humana

Publicado por Ciudad Universitaria Virtual de San Isidoro

En los estudios de la evolución molecular, se ha observado que el cambio de secuencias de proteínas parece ocurrir a una velocidad proporcional al tiempo que se produce la divergencia evolutiva de las especies. Este hecho se ha denominado reloj molecular. Tras varias décadas de estudios, se sabe mucho más de cómo los cambios a nivel molecular se acumulan a lo largo del genoma. A través de la técnica genética del reloj molecular se puede estimar el tiempo pasado a partir del número de diferencias entre dos secuencias de ADN.


El principio del reloj molecular

A principios de 1960, los científicos especializados en el campo de la Biología comenzaron a investigar cómo las proteínas de diferentes especies evolucionan a nivel de secuencia. Las primeras proteínas analizadas fueron la hemoglobina, el citocromo C, y fibrinopéptidos. Estas primeras investigaciones condujeron a un descubrimiento notable: el número de diferencias entre las secuencias de proteínas de diferentes especies son proporcionales al tiempo de divergencia de las especies.

Representación de la proteína mioglobina
Representación de la proteína mioglobina

Emile Zuckerkandl y Linus Pauling, en 1965, compararon la constante acumulación de las sustituciones de aminoácidos de la hemoglobina entre linajes con la tasa evolutiva de divergencia basada en la evidencia fósil, sugiriendo algo similar a las manecillas de los relojes. El término reloj molecular se utilizó inicialmente para describir los cambios en los aminoácidos que ocurren en proporción al tiempo transcurrido desde la divergencia de especies. También se aplicó a la evolución de las secuencias de ADN, en particular a la teoría neutralista de la evolución molecular.

El término de reloj molecular se ha utilizado en contextos distintos. Se utiliza a menudo para referirse simplemente al número de cambios o sustituciones acumulados en la secuencia de ADN o proteínas en un linaje genético. El número de sustituciones por unidad de tiempo definido es el valor del reloj molecular, que en este contexto es equivalente al valor de la velocidad de evolución.

El concepto de un reloj molecular tiene implicaciones extraordinarias para los biólogos evolutivos. Si el reloj molecular como se había propuesto inicialmente existía, resolver el calendario de eventos evolutivos se convertiría en un problema bastante sencillo. Sin embargo, ha quedado suficientemente claro que las sustituciones no se producen regularmente en el tiempo en líneas genéticas distintas. Sin embargo, el concepto de reloj molecular ha influido enormemente en el campo de la evolución molecular. Una de las ideas más importantes inspiradas en el concepto del reloj molecular es la teoría neutralista de la evolución molecular.


El reloj molecular y la teoría neutralista de la evolución molecular

Cuando la idea de un reloj molecular surgió, se pensó que la fuerza evolutiva predominante de sustituciones de aminoácidos o nucleótidos era la selección natural. Siguiendo esta línea de pensamiento, un reloj molecular indicaría que las sustituciones de adaptación en diferentes especies se encontrarían situadas en el tiempo. Pero no es así de sencillo. En teoría, las mutaciones adaptativas se determinan por varios parámetros evolutivos, tales como la ventaja selectiva de la mutación, el tamaño de la población, y las tasas de mutación de adaptación. Estos parámetros pueden diferir entre las especies, e incluso dentro de una especie, en función de las mutaciones específicas y sus interacciones con el entorno.

Kimura en 1968 sostuvo que la mayoría de los cambios a nivel molecular tienen pocas consecuencias funcionales, esto quiere decir que son neutrales. Si una mutación no tiene ninguna consecuencia, su destino en la población está completamente determinado por el azar. Esto implica que no se puede predecir si una mutación neutra específica con el tiempo puede quedar fija en la población. Sin embargo, la tasa a la que se producen las sustituciones neutras en la población se puede predecir porque depende de un solo parámetro, la tasa de mutación.

La teoría neutralista de la evolución molecular de Motoo Kimura afirma que la gran mayoría de los cambios evolutivos a nivel molecular son causados por la deriva genética de mutantes selectivamente neutros. En su momento, algunos especialistas la vieron como un argumento contra la teoría evolucionista de Darwin por medio de la selección natural. Entonces Kimura sostuvo, con el acuerdo de la mayoría de quienes trabajan en biología evolutiva, que las dos teorías son compatibles, ya que la teoría neutralista no niega el papel de la selección natural en la determinación del curso de la evolución adaptativa, pero atribuye un gran papel a la deriva genética.

Si tenemos una población con N número de individuos haploides, si se producen mutaciones neutrales a la tasa relación U por individuo por generación, el número total de mutaciones en una generación será N veces U, o sea N x U. Todas estas nuevas mutaciones son neutrales y sus destinos están totalmente determinados por el azar. La probabilidad de que cada nueva mutación neutra llegue a ser fijada y estable, que perdure en la población, es 1/N. La tasa de sustituciones se calcula como el número de nuevas mutaciones en cada generación (NU) multiplicado por la probabilidad de cada nueva mutación llegue a ser fija y estable (1/N), siendo igual a U (NU x 1/N = U). En conclusión, para las mutaciones neutrales, la tasa de sustitución es igual a la tasa de mutación.

De esta manera, si la mayoría de las mutaciones son neutrales, tal y como se propone en la teoría neutralista, y las tasas de mutación son constantes en el tiempo, las sustituciones deberían ocurrir también de forma constante en el tiempo. Deberían concordar entonces las tasas del reloj molecular con las sustituciones a nivel molecular. Kimura, en 1969, observó que los cambios del reloj molecular eran relativamente constantes en las secuencias de proteínas como un fuerte apoyo a la teoría neutralista de la evolución molecular.

Más adelante, Allan Wilson y Vincent Sarich, a partir de su trabajo y el de Kimura, comprobaron que los errores espontáneos en la replicación del ADN provocan mutaciones que dirigen la evolución molecular, y que la acumulación de diferencias evolutivas neutrales entre dos secuencias podría usarse para medir el tiempo, si pudiera establecerse la tasa de error de la replicación del ADN. Para ello, utilizaron como referencias pares de grupos de especies vivas cuya fecha de especiación era ya conocida a partir del registro fósil.

En principio, se asumió que la tasa de error de la replicación del ADN era constante, no a lo largo del tiempo, sino en todas las especies y en cualquier parte del genoma que quisiera comparar. Dado que las enzimas que replican el ADN difieren muy ligeramente entre especies, en principio esta hipótesis parecía razonable. Sin embargo, conforme fue acumulándose evidencia molecular, la hipótesis de la constancia de la tasa de cambio se demostró falsa, al menos como hipótesis general. No obstante, a pesar de que la hipótesis del reloj molecular no puede asumirse completamente, funciona muchas veces, aunque ha de comprobarse en cada caso.


Avances en la técnica del reloj molecular

De acuerdo con la teoría neutralista, la cuestión de si las tasas de sustitución son constantes en el tiempo o no, equivale a si las tasas de mutación neutras son constantes en el tiempo. Por esta razón, muchos estudios posteriores se centraron en el análisis de datos de sitios neutrales para determinar si las tasas de mutación neutras son constantes en el tiempo.

La mayoría de los análisis empíricos de los relojes moleculares neutros se basan en la teoría de que las tasas de mutación neutral pueden ser deducidas de las tasas de sustitución neutras, a partir de la hipótesis de Kimura. En la práctica, cada estudio establece un cierto tipo de sitios en el genoma como sitios neutrales, y compara las tasas de sustitución de estos sitios entre linajes.

Antes de la secuenciación del genoma, la mayoría de los datos de las secuencias disponibles eran los de las secuencias de ADN codificantes de proteínas. Los estudios a menudo dividen las secuencias de ADN codificantes de proteínas en dos tipos de sitios: aquellos en los que cualquier cambio puede dar lugar a sustituciones de aminoácidos (sitios no sinónimo) y los que el cambio no produce una sustitución de aminoácidos (sitios sinónimos). Los relojes moleculares en sitios sinónimos deberían estar más cerca del reloj molecular neutro que los relojes en sitios no sinónimos.

A medida que avanzaba técnicas de secuenciación, algunos estudios utilizaron intrones como sustitutos de los sitios neutrales, ya que no se incorporan en los ARNm maduros, y por lo tanto son más propensos a ser neutral (Yi et al . 2002). Las secuencias de elementos transponibles inactivos que se insertaron mucho antes de que también se emplea a menudo la divergencia de especies (se refieren a menudo como "ancestrales repite ', por ejemplo, Thomas et al ., 2003). Por último, algunos estudios utilizaron secuencias de ADN no codificante (todas las secuencias después de eliminar las secuencias de ADN codificantes de proteínas) extraídos de todo el genoma alineaciones para probar los relojes moleculares neutros (Elango et al . 2006, Huttley et al . 2007).

La prueba más utilizada es la denominada prueba de velocidad relativa, establecida por Sarich y Wilson en 1973. Inicialmente, las tasas de sustitución por unidad de tiempo se calcularon dividiendo el número total de diferencias, sustituciones, entre las proteínas de diferentes especies por el tiempo de divergencia, datos estimados a partir de los registros fósiles. Pero los registros fósiles no están disponibles para muchas comparaciones y se asocian con grandes márgenes de error.

Casi todas las controversias en el seno de los debates sobre los relojes moleculares neutros se derivan de la pregunta de cuales son las principales fuentes de las mutaciones. Esta pregunta es absolutamente relevante para la comprensión de los patrones de mutación, que son la fuente del cambio evolutivo y la enfermedad genética. Por otra parte, la comprensión de cómo las tasas de mutación varían entre linajes y dentro de los genomas es una cuestión fundamental en la genómica comparativa, que tiene como objeto utilizar las comparaciones de secuencias para identificar las regiones genómicas que son funcionalmente importantes.


El reloj molecular en los homínidos

Durante mucho tiempo se ha considerado que la mayoría de las mutaciones se deben a errores en la replicación del ADN. Dado que las mutaciones se producen cuando se replica el ADN para la siguiente generación, estas se acumularán en proporción al número de generaciones, en vez de en proporción al tiempo absoluto. Por lo tanto, si se comparan las sustituciones que se han acumulado en dos linajes desde su divergencia, el linaje con tiempo de generación más largo, después de haber sido sometidos a un menor número de eventos de replicación de ADN, tendrá menos sustituciones que el linaje con más corto tiempo de generación. En consecuencia, el reloj molecular debe funcionar más lentamente en las especies con tiempos de generación más elevada. Esta idea se conoce como el efecto del tiempo de generación.

De hecho, el efecto del tiempo de generación fue observado por primera vez en los estudios de primates, incluso antes del debate sobre el reloj molecular. Morris Goodman, que estaba utilizando métodos inmunológicos para investigar la relación de especies, observó que la velocidad a la que divergen algunas proteínas era menor en los seres humanos que los monos del Viejo Mundo. Este efecto se conoce como tasa de desaceleración de los homínidos. Desde que los humanoides tenían tiempos de generación más largos que los monos del Viejo Mundo, esta observación puede ser explicada por el efecto del tiempo de generación.

Wu y Li, en 1985, fueron los primeros en probar la hipótesis del efecto del tiempo de generación a partir de datos de secuencias de ADN de primates y roedores. Dado que los primates tienen un tiempo de generación más largo que los roedores, el reloj molecular debe ser más rápido en los roedores que en los primates. Sus investigaciones concluyeron que los roedores muestran aproximadamente el doble de la tasa de evolución molecular en comparación con los primates. Sin embargo, para los sitios no sinónimos no se encontró tal efecto.

Estudios posteriores proporcionan un mayor apoyo a la tasa de desaceleración de los homínidos y la diferencia de tasas entre los roedores y los linajes de primates. Por otra parte, se observó una diferencia en la tasa de escalas filogenéticas incluso más pequeñas, especialmente en primates. El reloj molecular humano corre más lento que el del chimpancé. Los diferentes tipos de relojes moleculares observados en estos estudios concuerdan con el efecto del tiempo de generación.

Sin embargo, las diferencias reales entre linajes no concuerdan con la diferencia en los tiempos de generación. Kumar y Subramanian, en 2002, mostraron que a pesar de la diferencia en los tiempos de generación entre los primates y los roedores es mucho más grande que la que existe entre los humanos y los monos del Viejo Mundo, las diferencias observadas en los relojes moleculares son similares. La diferencia en los relojes moleculares de primates y roedores parece mucho menor que la propuesta originalmente por Wu y Li. Las diferencias en los relojes moleculares varían significativamente entre los diferentes estudios debido a las diferencias en los conjuntos de datos y métodos estadísticos. También muestran que las diferencias de tasas entre linajes no pueden ser completamente explicadas solamente por la diferencia en los tiempos de generación.

Parecen existir otros factores. Martin y Palumbi, en 1993, demostraron que los relojes moleculares de ADN se ejecutan más rápido en las especies con tamaño corporal pequeño. Esta observación llevó a la hipótesis de que las tasas metabólicas son importantes en los relojes moleculares. Una alta tasa metabólica produce un gran número de radicales de oxígeno mutagénicos, lo que aumentaría las tasas de mutación. Dado que las tasas metabólicas y el tamaño del cuerpo en general, varían con los tiempos de generación, ha sido difícil distinguir cuál de ellas constituye el principal determinante de la velocidad del reloj molecular. Tsantes y Steiper, en 2009, propusieron, en base a los datos de los primates, que la edad de la primera reproducción, más que el tamaño del cuerpo, es el principal determinante de los relojes moleculares, ya que la edad de la primera reproducción refleja el efecto del tiempo de generación. Sin embargo, hoy por hoy, sólo se ha comprobado en un número limitado de linajes.

La metilación del ADN es una modificación química del ADN genómico encontrado en diversos taxones. En los genomas de animales, la metilación del ADN se produce casi exclusivamente en las citosinas seguidas por las guaninas. Las citosinas metiladas tienden a mutar rápidamente a timinas debido a la inestabilidad química. En el genoma humano, las mutaciones causadas por la metilación del ADN se producen con más frecuencia que otras mutaciones. Debido a que las mutaciones causadas por la metilación del ADN se producen en gran medida independientemente de la replicación del ADN, tales mutaciones pueden seguir diferentes relojes moleculares. En concreto, en lugar de depender del tiempo de generación, las mutaciones causadas por la metilación del ADN pueden seguir un reloj molecular en función del tiempo, que sería algo similar a lo propuesto inicialmente por Zuckerkandl y Pauling en 1965.

Para probar esta hipótesis, Kim y su equipo, en 2006, compararon la divergencia humano-chimpancé con la divergencia macaco-babuino, dos pares de especies que comparten tiempos de divergencia similares, pero con diferentes tiempos de generación. El par humano-chimpancé (el par humanoide) tiene tiempos de generación más largos en comparación con el par macaco-babuino (el par de monos del Viejo Mundo). Este estudio demostró que el par macaco-babuino, monos del Viejo Mundo acumula aproximadamente un 30% más sustituciones, lo cual se explica por la tasa de desaceleración de los homínidos, pero otros sitios del genoma mostraron similar número de sustituciones en los homínidos y en el par de monos del Viejo Mundo. Por lo tanto, la suposición de que un solo reloj molecular puede existir para un determinado linaje ya no es válida, porque las fuerzas de mutación predominantes varían entre regiones genómicas.

En lugar de tomar un solo reloj molecular neutro para cada genoma, los estudios futuros deben tratar de revelar la variación de los relojes moleculares en las zonas neutras del genoma, para conocer más a fondo las mutaciones genómicas. Tal información no sólo es útil para la comprensión de la materia prima que rige la evolución molecular y la enfermedad genética, sino que también constituye un componente crítico que puede identificar regiones genómicas funcionales.

Temas de Paleontología Humana (Paleoantropología)

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