lunes, 16 de febrero de 2015

Extracción de ADN. Práctica virtual

Publicado por Ciudad Universitaria Virtual de San Isidoro
Extracción de ADN

En 1868, el ADN fue identificado por primera vez por el biólogo suizo Friedrich Miescher, al observarlo en los núcleos de las células del pus en los vendajes quirúrgicos desechados y en el esperma del salmón, denominando nucleína a la sustancia. Oswald Avery, en 1944, determinó que era el responsable de la herencia genética, demostrándolo en un famoso experimento. En 1953, Watson y Crick propondrían su modelo de doble hélice.

En esta práctica se extraerá el ADN de las células bucales humanas, epiteliales, que son las del revestimiento interno, y/o de células vegetales. Es un primer paso en la práctica de laboratorio biotecnológico. La muestra de ADN obtenida es una muestra impura que posteriormente se purificaría mediante enzimas.


Introducción

- Lectura: Aula Virtual de Biología. Ácido desoxirribonucleico o AND o DNA


Guión de la práctica

Como muestra se utilizarán células epiteliales humanas de la boca y células vegetales.


Preparación de la muestra

En la preparación de la muestra, se trata de extraer  el ADN que se encuentra en el núcleo, mitocondrias y cloroplastos de la célula. Este paso es la homogeneización de los tejidos.


Extracción de células bucales humanas

1) Añadir una cucharada de sal a 500 ml (medio litro) de agua. Mezclar y remover hasta que la sal se disuelva.

2) Llenar medio vaso (aproximadamente tres cucharadas) con el agua preparada anteriormente.

3) Llevar las aproximadamente las tres cucharadas anteriores a la boca, removiéndolas en ella (enjuagándose) durante medio minuto a un minuto.

4) Escupir el agua de la boca en el vaso. Ahora contendrá células epiteliales de la boca.


Preparación de la  muestra vegetal

1) Se corta la muestra vegetal (como puede ser cebolla, ajo, tomate, fresa, etc.) en dados, en trozos lo más pequeños posibles.

2) Se trituran o machacan los trozos vegetales (con batidora o mortero de porcelana) con el fin de romper las células.

3) Se filtra la muestra para eliminar trozos groseros y pieles.


Material necesario

- Agua, preferiblemente destilada, si no, embotellada. No usar agua del grifo.
- Vasos de precipitados
- Vaso de bebida
- Jabón líquido (no debe contener antimicrobianos)
- Sal común (cloruro sódico).
- Etanol, alcohol isopropílico o alcohol isoamílico.


Procedimiento


1) Homogeneización de los tejidos, visto anteriormente como preparación de la muestra.


2) Preparación del tampón de lisis

Se preparará la siguiente solución:

- 250 ml (cuarto de litro) de agua mineral.

- Una cucharada de cloruro sódico (sal de mesa). Cuyo fin  neutralizar la carga negativa de los grupos fosfato en el ADN, disminuyendo la solubilidad de las proteínas, lo que hace que precipiten y se separen más fácilmente del ADN.

- 2 cucharadas de bicarbonato sódico. Su fin es evitar que el pH de la disolución suba o baje mucho.

- 2 chorritos de detergente  Su fin es romper las membranas de los orgánulos para liberar el ADN. El detergente disuelve las grasas y al igual que se emplea para limpiar la grasa de la piel, con él se rompen las membranas plasmática y nuclear, cuyo componente principal son grasas (lïpidos), permitiéndose la salida del ADN al exterior.

Una medida exacta cuantitativamente puede ser la siguiente, o sus proporciones respectivas:

- 120 ml de agua, si es posible destilada y si no mineral.
- 1,5 g de sal de mesa (cloruro sódico), preferiblemente pura.
- 5 g de bicarbonato sódico.
- 5 ml de detergente líquido o champú.


3) Solubilización de las membranas

Se mezclan 10 ml de la solución que contiene la muestra con 20 ml del tampón de lisis.

Se agita despacio, para no crear burbujas, durante dos minutos. Se filtra


4) Extracción del ADN

Se retiran 5 ml a un tubo de ensayo y se añade lentamente con una pipeta o recipiente unos 10 ml de alcohol, ya sea, etanol, isopropílico o isoamílico. El alcohol es mejor que esté frío, en torno a unos 0 ºC.

Se debe escurrir lentamente por la cara interna del recipiente, estando este incllinado. El alcohol queda flotando sobre el tampón. Se puede utilizar una varilla de vidrio o cucharilla para ayudar a que caiga más despacio.

Al no ser soluble el ADN en alcohol, se separan en la interfase las cadenas blancas de ADN, formadas por miles de moléculas de ADN unidas, a veces formando grumos. Además, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales permanecen en la solución acuosa.


5) Recogida del ADN

Se toma una varilla fina y se introduce hasta justo debajo de la separación entre el alcohol y el tampón. Se remueve la varilla hacia atrás y hacia delante. Poco a poco se irán enrrollando los fragmentos de ADN de mayor tamaño.

Pasado un minuto, retirar la varilla de la capa de alcohol. El ADN estará adherido a su extremo.


Variantes

1) El tampón de lisis se puede elaborar directamente en la solución de la muestra o por partes. Se puede prescindir del bicarbonato sódico, pero no de los otros componentes.

2) Se puede añadir a la solución acuosa de la muestra, zumo de piña o papaya, ya que contiene un tipo de enzimas, papaína, que ayuda a eliminar las proteínas que pueden contaminar el ADN. Igualmente podemos añadir ablandador de carne, que por otra parte, también suele estar hecho a base de papaína.

3) Se puede añadir colorante, como puede ser el alimentario, para visualizar mejor el proceso y ver las hebras de ADN sobre el fondo.

4) Se puede añadir líquido de lentillas para eliminar las proteínas que degradan el ADN.

5) Se puede aplicar un calor muy suave a la solución que contiene la muestra. El calor ayuda a la rotura de las membranas por su acción ablandante sobre los fosfolípidos y también desactiva (desnaturaliza) las enzimas desoxirribonucleicas (ADNasas) las cuales, si están presentes, pueden cortar el ADN en pedazos tan pequeños que lo harían imposible de ver. Pero si las enzimas se desnaturalizan y el ADN se desenrolla, pierde su forma volviéndose inactivo. Las enzimas se desnaturalizan a 60° C y el ADN se desnaturaliza a 80° C.


Notas

- Si se expone durante bastante tiempo la muestra a rayos ultravioletas, como los del Sol, se provocan daños a la estructura del ADN. Ocurre igual si se añaden ciertos conservantes.

- Para conseguir el ADN puro es necesario añadir enzimas, ya que además de ADN, se encuentran, entremezclado con él, fragmentos de ARN. Las enzimas fragmentan las moléculas de ARN e impiden que se unan al ADN.

- Tanto en la boca, como en los vegetales, además de las propias células, también hay bacterias, por lo que el ADN, además del de las células, es el de las bacterias.

- El alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales se encuentran en la solución acuosa.

- El proceso de extracción de ADN es el primer paso para muchos procedimientos (protocolos) de laboratorios de biotecnología.

- Si se quiere conservar el ADN se puede dejar secar sobre un papel de filtro. También se puede observar la estructura fibrilar al microscopio o lupa binocular

- La adición de alcohol es el parte más delicada, ha de hacerse lentamente y por las paredes del recipiente.


Formas de realizar la práctica

1. En laboratorio.

2. En laboratorio casero. En principio, la práctica no tiene peligrosidad.

3. De manera virtual

A través de la visualización con atención de los siguientes vídeos o de una práctica virtual.


ADN de células vegetales



ADN de células bucales humanas



Práctica virtual

Se puede simular todo el proceso, tal y como se haría en el laboratorio, con esta aplicación web de la Universidad de Utah:


Preguntas y actividades

1. Razonar, a partir de esta experiencia, por qué resulta claro que el ADN es una macromolécula con una organización espacial.

2. ¿La muestra obtenida de ADN es del núcleo celular o procede de otras partes de la célula? ¿es sólo ADN o también hay ARN? ¿es ADN de las células bucales humanas y de las células vegetales o hay además otro tipo de ADN?

3. Establecer la función de todos los pasos dados para obtener el ADN. ¿Se podrían añadir más para obtener un procedimiento más elaborado?

4. Repasar la estructura y funciones del ADN. Actividad opcional: construcción de un modelo en 3D.


Para saber más y ampliar conocimientos

- Lectura: Ciencia y Biología. Extracción de ADN
- Lectura: IES Juana de Pimentel. Extracción de ADN
- Lectura: Medicina Joven. Como extraer ADN de forma casera
- Lectura: Monografías.com. Informe de un experimento (extracción de ADN)
- Lectura: Nota Mínima. Extracción casera de ADN


Principios de Biología

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